刘畅a翻译，曹彦硕a,b审校

a医院消化肿瘤内科；b中国临床肿瘤学会（CSCO）翻译小组

本文刊选自年第1期《肿瘤学年鉴中文版-胃肠肿道瘤专刊》，经授权在聚焦oncology上发表。未经授权，严禁转载。

原文出处：Smyth,E.C.,etal.,Aseven-GeneSignatureassayimprovesprognosticriskstratificationofperioperativechemotherapytreatedgastroesophagealcancerpatientsfromtheMAGICtrial.AnnOncol,.29(12):p.-.

背景：在新辅助化疗后的可手术胃食管癌患者中，淋巴结转移是唯一经过验证的预后因素。然而，在淋巴结分组内仍然存在复发风险的异质性。由此我们提出假设，新辅助化疗后的胃食管癌患者的手术切除标本的基因表达谱可用于预后危险分层，从而划分出不同的复发风险组别。

患者和方法：使用NanoString平台定制的胃癌基因检测面板，对MAGIC研究中接受围手术期化疗的例患者样本（具有高质量RNA）进行检测。通过惩罚和标准Cox回归分析确定与总生存（OS）相关的基因，然后生成风险评分并建立NanoString生物标志物检测，对患者进行与总生存相关的危险分层。应用一个独立的数据集作为验证队列。

结果：通过对MAGIC研究的患者进行回归和聚类分析，制定出一个7-基因检测面板和2个具有不同OS的风险组[风险比（HR）5.1；P0.]。高危组和低危组的中位OS分别为10.2月[95％置信区间（CI）6.5~13.2月]和80.9月（95%CI：43.0月-未达到）。多因素分析中，风险组别是独立于淋巴结转移的独立预后因素（淋巴结阳性组HR3.6，P=0.02；高危组HR3.6，P=0.），但在单纯手术组患者中无预后意义（n=;logrankP=0.2）。验证队列独立证实了这些结果。

结论：结果表明，基于基因的危险分组可以独立预测新辅助化疗后胃食管癌患者的预后。在未来基于围手术期化疗的临床试验中，这种标记法及相关检测可能有助于对这些患者进行术后化疗的危险分层。关键词：胃癌，食管癌，围手术期化疗，预后生物标志物，MAGIC研究，统计回归分析

围手术期化疗是可切除胃癌和食管癌患者的标准治疗策略，这种多手段疗法可以使得近50%的患者得到治愈。对于手术后很可能复发的患者，改进手术后的危险分层，并着重开发新的治疗策略很有价值。然而，对化疗前的活检组织样本进行DNA和RNA的提取是相对困难的，使得通过分子分层指导术前治疗决策有很大局限性。因此，应用化疗后手术切除标本进行预后分层分析可能具有临床应用价值。

MAGIC研究是一项大型Ⅲ期随机对照临床试验，患者被随机分为两组，一组在围手术期应用表柔比星+顺铂+5-氟尿嘧啶（ECF）方案化疗（手术前后各化疗3个周期）联合手术，另一组为单纯手术组。该研究的结果确立了接受围手术期化疗患者的生存获益，并针对可切除胃食管癌建立了以铂类-氟尿嘧啶类药物为基础的标准围手术期化疗方案。由此我们假设，通过对于MAGIC研究中接受围手术期化疗患者的手术切除标本进行转录组学分析，可能区分出不同生存结局的患者亚组。本文通过对MAGIC研究的患者进行危险分层的相关分析结果，在另一个独立且相似的患者队列中进行了验证。

患者样本

在MAGIC研究随机入组的患者中（n=；图1A），获得福尔马林固定-石蜡包埋（FFPE）手术切除标本（份，具有高质量RNA）进行基因分析，同时具备临床病理资料。验证队列包括前瞻性收集的在RoyalMarsden医院（RMH）和英国伦敦Guys及StThomas医院（GSTT）切除的胃食管癌患者样本的数据库。在该数据库中，由RMH和癌症研究所/国立癌症研究生物医学研究中心资助转化协议（PROGRESS）。并获得机构审查委员会批准（MAGIC：IRAS11/LO/;PROGRESS：IRAS15/EE/）。

图1.统计方法的配对图和流程图。（A）配对图显示了MAGIC研究中确认有手术标本，且纳入本研究的患者。（B）流程图展示了基因选择、危险分层及验证的统计流程。NanoString代表NanoStringTechnologies的nCounter测定。

基因表达谱分析

对来自MAGIC研究的样本进行了包含个基因的分析（包括个与胃癌亚型表征相关的基因；其他则包括了在胃食管癌中常见到的扩增/缺失或与化疗敏感性相关的基因），并应用NanoString平台对PROGRESS（来自上述基因的子集）进行研究分析。

基因选择和风险组识别

用于将患者分层到不同风险组的流程图详见图1B。首先，选择在至少75％的样品中表达的基因。使用惩罚性Cox回归通过将数据反复分裂（次）进入训练/测试随机组别，选择频率超过80％的基因作为潜在的预后标志，来识别围手术期治疗组中与OS相关的基因。接下来，将标准Cox回归模型与所选基因的表达数据相匹配，以显著地识别出可靠的与OS相关的基因（P0.05）。最后，围手术期治疗组中第i例患者的风险评分（死亡风险）-Ri，由如下公式计算：

其中p是所选基因的数量，βj是Xj（即基因j）表达的回归系数（风险比的自然对数；HR）。然后基于中位阈值或无监督的K均值聚类方法，使用风险评分将患者分为不同的风险组。使用多因素Cox分析评估风险组的预后价值。

在MAGIC研究中，名患者被随机到单纯手术组或围手术期化疗组，其中名（91％）患者接受了手术，并有明确的可用于生存分析的手术日期。对入组本研究中可获得组织和不可获得组织的患者进行nCounter分析，两者间的OS没有显著差异（log-rankP=0.3）。使用了应用例MAGIC研究患者的FFPE样本定制的nCounter基因表达谱（参见图1A，配对图），患者的临床病理学特征详见表1。

通过对84名接受了围术期化疗联合手术治疗的患者进行惩罚Cox回归分析，我们发现了14个、频率至少达80%的预测基因（图1B和图2A）。通过对选取的14个基因进行标准Cox回归分析，最终得到7个基因（CDH1、ELOVL5、EGFR、PIP5K1B、FGF1、CD44v8.10和TBCEL；命名为GC-RiskAssigner标记），仅在围手术期化疗组中具有预后作用。为了将患者分层至不同的风险组，我们计算了每位患者的风险评分，即量化死亡风险的数字量度。通过将这7个基因（G-CRiskAssigner）的表达值与其相应的HR（代表与每个基因相关的风险）相乘来得到风险评分。最后，根据患者的风险评分将患者分为两个（低/高）或三个（低、中、高）风险组。

图2.使用惩罚Cox回归进行基因选择并确定MAGIC围手术期化疗患者的风险分层。（A）图中显示通过惩罚Cox回归选择基因的频率（在0和1之间）和相应的回归系数。水平灰色虚线表示以0.8频率选择的14个基因。具有正回归系数的基因的高表达（红点表示）与最差的预后相关，而紫点代表的基因与预后良好相关。（B）基于中位阈值对GC-RiskAssigner风险评分进行二分法来确定危险分层的箱线图。（C）Kaplan-Meier图显示了使用风险评分中位值作为阈值得出的两个风险组的预后生存曲线。（D和E）使用K均值聚类方法识别的三个风险组的箱线图和Kaplan-Meier曲线。

当根据患者是否属于中位风险评分（中位数作为分界线）的下半部分（低危）或上半部分（高危）分为两组时（图2B），高危组的中位OS为10.2月（95％CI：6.5~13.2月），而低危组的中位OS达到80.9月（95％CI：43.0月-未达到）[HR=5.1（95％CI：2.8~9.2）；P0.；图2C]。此外，当使用K均值聚类方法根据风险评分划分为3个风险组时，高危组和中危组的中位OS分别为6.5月（95％CI：5.1~11.6月）和22.6月（95%CI：17.1~54.3月），低危组则无法评估（图2D和E，CoxP0.）。两个和三个风险组患者的1年、3年和5年生存率详见补充表S2B。

对包括淋巴结状态等因素进行多因素分析，以确定危险分层是否是围手术期化疗患者OS的独立预后因素。表2显示，当控制了唯一已知的生存混杂因素——淋巴结状态时，危险分层仍然可以预测OS。相反的，当将GC-RiskAssigner应用于单纯手术组的患者，这7个基因均与OS无相关性（补充表S2A，请参见《肿瘤学年鉴》在线）；且在使用中位数进行分界的两个风险组的OS间也未见显著差异（log-rankP=0.2；图3A）。

图3.在单纯手术患者中的危险分层以及验证队列中危险分层的验证。Kaplan-Meier曲线分别显示了（A）单纯手术患者的危险分层之间和（B）验证队列中预测的危险分层之间的OS差异（C）验证队列中危险分层和淋巴结状态的多因素分析。HR和P分别表示风险比和P值。

通过对MAGIC样本使用受试者工作特征（ROC）曲线分析来评估GC-RiskAssigner的7个基因在预测风险组中的作用。曲线下的平均面积高达0.97（95％CI：0.97-0.98），这证实了GC-RiskAssigner在预测两个围手术期风险组中的优异表现。接下来，进行了基于微阵列预测分析（PAM）的形心（代表每个风险组中每个基因的综合基因表达），对MAGIC样本中基于中位数分组的两个风险组应用GC-RiskAssigner标记进行预测分析，并开发出针对相同基因的nCounter平台生物标志物测定。基于每个患者基因表达谱与GC-RiskAssignerPAM形心关联后（Pearson相关）的最大相关系数值，将来自PROGRESS验证队列的患者（n=47；表3）分配至不同的风险组。高危组的死亡风险（HR=2.7；95％CI：1.3~5.6；P=0.；图3B；补充表S3B）几乎是低危组的三倍。高危组的中位OS为20.4月（95％CI：12.4~32.5月），而低风险组中位OS为39.4月（95％CI：30.5月-未达到）。两个预测风险组中患者的1年、3年和5年生存率详见补充表S3C。针对风险评分和淋巴结转移情况的多因素分析在验证队列中也证实了危险分层的独立预后价值（CoxP=0.01）（图3C）。

国际指南推荐，以铂类和氟尿嘧啶类药物为基础的围手术期化疗是可切除胃食管腺癌患者的标准治疗方案。在本项研究中，将MAGIC研究中接受了术前化疗的患者通过7-基因检测标记（GC-RiskAssigner）进行生存预后分组。应用NanoString检测的GC-RiskAssigner标记，上述发现在另一组独立的接受相同化疗联合手术的患者中也得到了验证。重要的是，基于GC-RiskAssigner标记的危险分层提供了独立于淋巴结转移因素的预后指标，这是迄今为止得到的最佳的围手术期化疗患者的预后变量。这些结果的潜在重要性在于，将来可以使用基于基因特征的危险分层来设计临床试验，从而筛选出最可能出现复发的患者，进而探索新的或更强化的术后治疗。

预测手术切除后生存的预后基因标记已在其他癌症中得到验证，其已被纳入激素受体阳性乳腺癌的常规临床实践中，在结肠癌中也有一些应用。这些和其他预后标记被开发用于未接受新辅助化疗的、仅接受了初始的手术的患者，并根据未治疗过的原发肿瘤的基因表达计算复发风险，以评估辅助化疗的获益可能。在转移性胃癌中开发了一种化疗后的基因表达标记，并在另一个队列中验证了其对生存的预后作用；然而，据我们所知，本研究报道的是针对已切除胃癌患者建立的第一个基因标记。尽管探索预测新辅助化疗疗效的基因标记是我们理想的目标，但是诊断标本中组织的有限性使这一目标颇具挑战。因此，建立一个基于化疗后的基因表达特征，使用更充足的手术切除的组织标本进行检测，成为更可行的解决途径。化疗后基因表达的动态变化在卵巢癌临床前模型以及“应用影像及分子分析评估你的治疗反应（I-SPY）”研究中的乳腺癌患者中显示出与生存的相关。然而，据我们所知，本项研究是首个在随机临床试验的背景下，首次提出了可切除胃食管癌患者新辅助化疗后的预后模型。

本项研究的局限性在于其为回顾性研究、基因选择的预先确定法，以及验证队列较小的样本量。尽管7-基因检测由仅包含个基因的基因组检测衍生而出，但这些基因之所以被选中，是因为其在胃食管癌中具有重要的生物学作用。重要的是，检测中包含的几个基因已在此前被认定在胃癌中具有预后作用。这些基因包括EGFR，其扩增与多项不良生存结局相关。CD44v8-10是胃癌干细胞的标志物，与接受化疗的胃癌患者化疗耐药和不良预后相关。此外，尽管验证队列PROGRESS并非来自临床试验数据库，但该队列中的患者接受的是与MAGIC研究中几乎相同的化疗方案。我们注意到，验证队列中包含更多的食管或食管胃结合部癌，而MAGIC研究中75%为胃癌患者。然而，这也可以被视为本研究结果的普适性而作为一项优势。由于MAGIC研究中每种化疗药物的贡献尚不清楚，因此下一步应当通过未接受过阿霉素、顺铂和5-氟尿嘧啶化疗的患者进行预后标记的验证。特别是近期发表的FLOT4-AIO研究结果，相比ECF/X化疗方案，围手术期的多西他赛+奥沙利铂+5-氟尿嘧啶（FLOT）能进一步改善OS。

参考文献（略）

专家介绍

曹彦硕，医学博士，医院消化肿瘤内科主治医师。主要专业方向为消化道肿瘤的内科治疗及临床研究。

年毕业于北京大学年于医院完成住院医师培训-年任住院总医师-年于PrincessMargareteCancerCentre,Toronto,Canada完成ClinicalFellowship