自从赛维健进入放疗食管癌指南后不少小伙伴询问赛维健作为放疗增敏剂的相关研究信息，今天就向雷粉们介绍一项重要研究——《雷替曲塞联合放疗在食管癌细胞中的作用及机制》，以供大家中秋回家路上阅读?

一、研究背景

食管癌是常见的消化道肿瘤，是全球死亡率第六位的恶性肿瘤，超过三分之一的患者在诊断时已发展为晚期食管癌。在中国，超过90%的食管癌患者为食管鳞状细胞癌（ESCC）。目前手术、放疗、化疗是三种主要治疗手段，其中对于不适合进行根治性切除的食管癌患者，放射治疗是应用最广泛的治疗方式。

然而，食管癌细胞中存在的很大一部分对放疗不敏感的肿瘤细胞会导致治疗失败，因此迫切需要发现提高放射敏感性的方法来降低食管癌的死亡率。

雷替曲塞（赛维健）作为特异性TS酶抑制剂，可阻滞肿瘤细胞DNA的合成与修复。多项临床研究已证实赛维健在结直肠癌、头颈部肿瘤、恶性间皮瘤等多种类型的癌症中显示出抗肿瘤作用。本研究致力于探索赛维健介导的放射增敏作用及潜在分子机制。

二、研究方法及相关结果

雷替曲塞增加ESCC细胞系敏感性

用不同浓度的雷替曲塞培养TE-13和Kyse细胞系24、48和72小时。雷替曲塞以时间和剂量依赖型方式抑制TE-13（图1a）和Kyse（图1b）细胞系的细胞活力。在0.1-nm的浓度范围内，雷替曲塞对TE-13和Kyse细胞的生长有抑制作用。

在TE-13和Kyse细胞系中，雷替曲塞在24小时的IC50分别为.7nM和.8nM。在TE-13和Kyse中，72h时雷替曲塞的IC50分别为19.61nM和6.19nM（表1）。因此，为了探索雷替曲塞对放射线的敏感性，在接下来的研究中研究者采用了可以最低限度抑制肿瘤细胞活性的4.8nM/24h进行细胞处理。

与单纯放射治疗相比，雷替曲塞与放射治疗相结合后，群落数明显减少（图1e，f）。采用多靶单击模型对存活率进行拟合，以估计增敏剂增益比（SER）。在TE-13细胞中，当雷替曲塞的剂量从4nM增加到8nM时，SER从1.31增加到2.10，而在Kyse细胞系中，SER从1.23增加到1.81。所有的数据表明，随着雷替曲塞剂量的增加，放射线增加了细胞死亡和抑制细胞增殖。

雷替曲塞促进放射诱导的细胞周期分布和蛋白质表达改变

为了进一步了解雷替曲塞与放射结合在ESCC细胞系中的作用，我们采用流式细胞仪分析了细胞周期分布。单纯放射可诱导TE-13（图2a）和Kyse（图2b）细胞株的G2/M停滞。随着放射剂量的增加，两个细胞系的G2/M期细胞阻滞呈剂量依赖性增加。

在雷替曲塞（4nm）处理24h、在放射线（4Gy）暴露24h后，分别总结TE-13和Kyse细胞系中不同组间各相细胞百分比（图2e，f）。在两个细胞系中，联合雷替曲塞和单纯放射组相比，G2/M期细胞显著增加。

如我们所知，DNA损伤常导致G2/M期停滞，而Cdc2/CyclinB1复合物对调控G2期细胞向M期的转换至关重要。Westernblot分析（图2g）显示，在不同时间点治疗后，TE-13和Kyse细胞中pCdc2（Thr14/Tyr15）增加。在Kyse细胞中，与单独照射组相比，雷替曲塞联合照射组中pCdc2的增加更早且更显著。CyclinB1的表达与pCdc2一致。雷替曲塞治疗24小时后，提示有丝分裂开始的Cdc25C和pCdc25C（SER）表达明显增加。

雷替曲塞增加放射诱导的细胞凋亡

分别用或不用雷替曲塞预处理24小时后进行放射线照射（24h或48h）后分析凋亡细胞和死亡细胞的发生率。在TE-13（图3a，c）和Kyse（图3b，d）细胞系中，雷替曲塞联合放疗组的细胞凋亡率明显高于单纯放疗或单纯化疗组。用免疫印迹法检测细胞凋亡相关蛋白，结果表明，与单纯放疗组或单纯化疗组相比，放化疗联合组的TE-13和Kyse细胞株c-Caspase3（细胞凋亡过程中最主要的终末剪切酶）显著增加（图3e），放化疗联合组促凋亡蛋白Bax也显著升高（图3e）

雷替曲塞增强放射所致

γ-h2ax灶点的形成

损伤DNA双链断裂（DSBs）的自我修复可能是雷替曲塞诱导癌细胞放射增敏的原因。因此，本研究通过在暴露于雷替曲塞和/或X射线后的不同时间点，对两个细胞系的γ-H2AX灶进行免疫荧光染色来评估DSBs水平。γ-H2AX灶在X射线照射后2小时开始增多，其中大部分在X射线（6Gy）照射后4小时清除（图4a-d）。在24小时，γ-H2AX灶的平均数量下降到接近基础水平。联合治疗组的γ-h2ax灶比单纯放疗组多。γ-h2ax的蛋白表达也证实了这一现象（图4f）。这些数据表明，赛维健可能通过抑制DSBs的修复来增加放射敏感性。

雷替曲塞提高异种移植裸鼠模型的放疗敏感性

为了证实雷替曲塞对ESCC体内肿瘤的潜在放射增敏作用，本研究建立了TE-13肿瘤细胞异种移植小鼠模型，在第0天进行雷替曲塞给药后，单次照射8Gy。0-4天和7-11天持续对裸鼠进行腹腔注射雷替曲塞（0.75mg/kg/天）。上图表明，雷替曲塞与放疗联合抑制了荷瘤裸鼠TE-13肿瘤细胞的增殖。雷替曲塞组与单纯照射组肿瘤体积无显著性差异。与对照组相比，治疗组肿瘤体积明显减小。与单纯放疗组和单纯化疗组相比，联合组的肿瘤体积和肿瘤重量均显著降低（P0.05）（图5a-c）。所有组均未观察到明显的体重减轻，这表明裸鼠对治疗具有良好的耐受性（图5e）

三、研究讨论

本研究首次证明，雷替曲塞在体外和体内均能增强ESCC细胞的放射敏感性。雷替曲塞干预后，ESCC细胞的存活率和增殖率均呈时间和剂量依赖性，联合放射可增加细胞凋亡。此外，研究发现雷替曲塞通过上调CDC2/cyclin-b1复合物和增加γ-h2axfoci表达抑制DNA损伤修复，导致G2/M期阻滞，从而对放射治疗产生增敏作用。此外，我们还观察到雷替曲塞对TE-13异种移植瘤的放射增敏。因此，雷替曲塞可作为一种有效的治疗ESCC的放射增敏剂。

Dingetal.CancerCellInt()19:36